نقش شرایط مختلف تجمع آنزیم هگزوکیناز نوع B مخمر در ساختار و سمیت آن روی سلول ها

نویسنده

دانشگاه پیام نور، گروه علمی زیست شناسی، تهران

چکیده

زمینه و هدف: تشکیل رسوبات پروتئینی آمیلوئیدی از ویژگی های مشترک گروهی از بیماری های وابسته به آمیلوئید از جمله آلزایمر، پارکینسون، دیابت نوع II و پریون می باشد. نوع تجمعات تشکیل شده در شرایط مختلف و مکانیزم تخریب عملکرد سلولی توسط این تجمعات، هنوز کاملاً مشخص نیست. در مطالعه حاضر توانایی هگزوکیناز نوع B مخمر (YHKB) برای تشکیل تجمعات منظم آمیلوئیدی و یا بی شکل در شرایط گوناگون و سمیت این تجمعات روی سلول ها مورد بررسی قرار گرفته است.
مواد و روش ها: در این مطالعه تجربی برای القای آمیلوئید از سه روش مرسوم ایجاد آمیلوئید استفاده شد. این روش ها شامل قرار دادن (1) YHKB در pH اسیدی، دمای 55 درجه ولی با هم زدن مداوم، (2) در pH اسیدی در حضور نمک و در دمای آزمایشگاه بدون هم زدن مداوم و (3) در حضور تری فلوئور و اتانول (TFE) بودند. نوع تجمعات تشکیل یافته در شرایط فوق به وسیله توانایی شان برای اتصال با رنگ تیوفلاوین T (شاخص آمیلوئید) و شکل تجمعات با عکس برداری به وسیله میکروسکوپ نیروی اتمی بررسی شد. همچنین سمیت تجمعات تشکیل یافته در شرایط ذکر شده، به وسیله اثر دادن آن ها روی سلول های نروبلاستومای انسانی SH-SY5Y و از طریق روش احیای MTT مقایسه شد.
یافته ها: تجمعات ایجاد شده در هر سه شرایط، توانایی اتصال به تیوفلاوین T (ThT) را داشتند ولی میزان اتصالشان متفاوت بود. عکس های میکروسکوپ نیروی اتمی (AFM) و الکترونی عبوری (TEM) نیز نشان داد که ساختارهای ایجاد شده از نظر ظاهری کاملاً با هم متفاوتند. تجمعات بی شکل و نامنظم این آنزیم هم برای مقایسه با تجمعات منظم به دست آمد. سنجش سمیت به وسیله روش احیای MTT نشان داد که تجمعات بی شکل در مقایسه با کنترل سمیتی برای سلول های نوروبلاستوما نداشتند ولی تجمعات حاصله در هر سه روش مذکور باعث تخریب سلول ها با شدت های متفاوت شدند.
نتیجه گیری: بر اساس یافته های این پژوهش، اختلاف در سمیت مشاهده شده تجمعات را می توان به اختلاف در مورفولوژی تجمعات تولیدی در شرایط مختلف و مکانیزم عمل متفاوت آن ها روی سلول ها نسبت داد.

کلیدواژه‌ها


عنوان مقاله [English]

The Role of Various Aggregation Conditions in Structure and Toxicity of Type B Yeast Hexokinase Aggregates

نویسنده [English]

  • Hasan Ramshini
چکیده [English]

Background and Purpose: Formation of well-ordered fibrillar protein deposits is common to a large group of amyloid-associated disorders، including Alzheimer’s، Parkinson’s، type II diabetes and prion diseases. The nature of the pathogenic species and the mechanism by which the aggregation process results in cell damage are، however، not well established. In the present study، the propensity of hexokinase type B from Saccharomyces cerevisiae (YHKB) to form amyloid-like and amorphous aggregates is investigated under various conditions and their cytotoxicity is determined.

Methods and Materials: In this experimental study، Amyloid-like aggregation was induced under three different conventional conditions including the preincubation of YHKB (1) in acidic pH، at 55 ºC and with agitation، (2) in acidic pH، room temperature، in presence of salt and without agitation، and (3) in the presence of trifluoroethanol (TFE). Types of aggregates in above conditions were compared for their capability to react with ThT (as a amyloid marker) and their morphology was analyzed by atomic force microscopy (AFM). Also، Cytotoxicity of the aggregates on human neuroblastoma (SH-SY5Y) were assayed by MTT reduction assay test.

Results: Aggregates produced under all three conditions had ThT binding ability but with different intensity. Atomic force microscopy indicated that aggregates morphologies in various conditions were completely different. Amorphous aggregates of the enzyme were also produced for comparing with ordered aggregates. Amorphous aggregates were not found toxic to human neuroblastoma cells، as indicated by the MTT reduction assay while those formed at acidic pH and in the presence of TFE indicated cytotoxicity.

Conclusions: Based on the findings، differences in cytotoxicity can be attributed to the variations in the nature and morphology of the aggregates in the conditions tested.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Yeast Hexokinase Type B; Amyloid Aggregation; MTT Reduction Assay; Cell Cytotoxicity