الکترود اصلاح شده الکتروشیمیایی جهت توسعه نانوبیوسنسور برای تشخیص ژن rfbE باکتری اشریشیاکولی O157:H7

نوع مقاله : مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 دانشجوی دکترای نانوبیوتکنولوژی، گروه و مرکز علم و فناوری زیست شناسی، دانشگاه جامع امام حسین(ع)، تهران، ایران

2 استاد، دکتری باکترای شناسی، گروه و مرکز علم و فناوری زیست شناسی، دانشگاه جامع امام حسین(ع)، تهران، ایران

3 دانشیار، دکترای شیمی تجزیه، گروه و مرکز علم و فناوری شیمی، دانشگاه جامع امام حسین(ع)، تهران، ایران

4 دانشیار، دکترای ژنتیک، گروه و مرکز علم و فناوری زیست شناسی، دانشگاه جامع امام حسین(ع)، تهران، ایران

چکیده

زمینه و هدف: نانوبیوسنسورها می‌توانند به­جای روش‌های تشخیص قدیمی باکتری اشریشیاکولی O157:H7 مورد استفاده قرارگیرند. در این تحقیق، یک نانوبیوسنسور برای تشخیص بخشی از ژن rfbE باکتری اشریشیا کولی O157:H7توسط تثبیت و هیبریداسیون توالی تک رشته DNAssDNA)) در سطح الکترود اصلاح شده با نانو ذرات طلا مورد بررسی قرارگرفته است.
موادّ و روش­ها: روش طیف بینی امپدانس الکتروشیمیایی برای بررسی خواص حسگری الکترود اصلاح شده مورد استفاده قرارگرفته است. سطح الکترود کار با روش الکتروشیمیایی توسط نانوذرات طلا اصلاح شد. توالی تک رشته­ی DNA تیوله با روش تک لایه­ی خود تجمعی، روی سطح الکترود طلا به­مدت دو ساعت تثبیت شد. تک لایه­ی مخلوط، شامل مرکاپتوهگزانول و مرکاپتوپروپیونیک اسید به­عنوان یک لایه­ی مسدودکننده استفاده گردید. هیبریداسیون DNA/DNA با غوطه‌ورسازی الکترود طلای اصلاح شده با ssDNA در غلظت 1 میکرومولار DNA هدف انجام شد.
یافته‌ها: نتایج نشان داد که الکترود اصلاح شده با نانوذرات طلا پس از تثبیت ssDNA، به­طور مؤثری ژن rfbE باکتری اشریشیا کولی O157:H7 را ازطریق هیبریداسیون DNA تشخیص می‌دهد. نانوبیوسنسور گزینش­پذیری بسیار خوبی در تشخیص توالی DNA هدف نسبت به توالی دارای باز ناجور و توالی غیر مکمل نشان داد.
نتیجه­گیری: با توجه به نتایج به­دست آمده و بررسی مطالعات مشابه، نانوبیوسنسور الکتروشیمیایی مبتنی بر هیبریداسیون DNA، دارای مزایایی ازجمله هزینه­ی کم، سادگی و کوچک سازی می‌باشد و می‌تواند زمینه‌ای برای توسعه­ی ابزار تشخیص ژنومی را فراهم آورد.

کلیدواژه‌ها


عنوان مقاله [English]

A Modified Electrochemical Electrode for Development of Nanobiosensor for the Detection of rfbE Gene of Escherichia Coli O157:H7

نویسندگان [English]

  • MohammadEbrahim Minaee 1
  • Mojtaba Saadati 2
  • Mostafa Najafi 3
  • Hossein Hinari 4
چکیده [English]

Background & Objectives: Nanobiosensors could be used instead of traditional detection methods of Escherichia coli O157:H7. In this paper, a nanobiosensor for detection of rfbE gene of the Escherichia coli O157:H7 has been studied by immobilization and hybridization single strand DNA (ssDNA) sequences on the electrode surface modified with gold nanoparticles.
Materials & Methods: Electrochemical impedance spectroscopy technique was used to study the properties of the sensing modified electrode. The working electrode surface was modified by electrochemical method with gold nanoparticles. The single-stranded DNA sequence using self-assembled monolayer was immobilized on the gold electrode for two hours. A mixed monolayer comprising both mercaptohexanol (MCH) and mercaptopropionic acid (MPA) were used as blocking layer. The hybridization DNA/DNA was performed by immersion of the modified gold electrode into ssDNA at a concentration of 1 μM  target DNA.
Results: The results showed that the electrode modified with gold nanoparticles after immobilizing ssDNA effectively detected rfbE gene of Escherichia coli O157:H7 by DNA hybridization . The nanobiosiosensor showed suitable selectivity for the detection of target DNA complementary sequence compared with the mismatched oligonucleotides sequence and the noncomplementary oligonucleotides sequence.
Conclusion: According to the results obtained and similar studies, the electrochemical nanobiosensor based on DNA hybridization has advantages such as low cost, simplicity, and miniaturization and can provide a basis for the development of genomic detection tools.

کلیدواژه‌ها [English]

  • DNA hybridization
  • Escherichia coli O157:H7
  • Nanobiosensor

 

 

 


الکترود اصلاح شده الکتروشیمیایی جهت توسعه نانوبیوسنسور برای تشخیص ژن rfbE باکتری اشریشیاکولی O157:H7

 

محمد ابراهیم مینایی1*، مجتبی سعادتی2، مصطفی نجفی3، حسین هنری4

1 دانشجوی دکترای نانوبیوتکنولوژی، گروه و مرکز علم و فناوری زیست شناسی، دانشگاه جامع امام حسین(ع)، تهران، ایران

2 استاد، دکتری باکترای شناسی، گروه و مرکز علم و فناوری زیست شناسی، دانشگاه جامع امام حسین(ع)، تهران، ایران

3 دانشیار، دکترای شیمی تجزیه، گروه و مرکز علم و فناوری شیمی، دانشگاه جامع امام حسین(ع)، تهران، ایران

4 دانشیار، دکترای ژنتیک، گروه و مرکز علم و فناوری زیست شناسی، دانشگاه جامع امام حسین(ع)، تهران، ایران

 

* نشانی نویسندهمسؤول: تهران، دانشگاه جامع امام حسین(ع)، گروه و مرکز علم و فناوری زیست شناسی، محمدابراهیم مینایی

E-mail: mminaii@ihu.ac.ir

 

وصول:20/12/93،اصلاح:7/2/94،پذیرش:18/4/94

چکیده

زمینه و هدف: نانوبیوسنسورها می‌توانند به­جای روش‌های تشخیص قدیمی باکتری اشریشیاکولی O157:H7 مورد استفاده قرارگیرند. در این تحقیق، یک نانوبیوسنسور برای تشخیص بخشی از ژن rfbE باکتری اشریشیا کولی O157:H7توسط تثبیت و هیبریداسیون توالی تک رشته DNAssDNA)) در سطح الکترود اصلاح شده با نانو ذرات طلا مورد بررسی قرارگرفته است.

موادّ و روش­ها: روش طیف بینی امپدانس الکتروشیمیایی برای بررسی خواص حسگری الکترود اصلاح شده مورد استفاده قرارگرفته است. سطح الکترود کار با روش الکتروشیمیایی توسط نانوذرات طلا اصلاح شد. توالی تک رشته­ی DNA تیوله با روش تک لایه­ی خود تجمعی، روی سطح الکترود طلا به­مدت دو ساعت تثبیت شد. تک لایه­ی مخلوط، شامل مرکاپتوهگزانول و مرکاپتوپروپیونیک اسید به­عنوان یک لایه­ی مسدودکننده استفاده گردید. هیبریداسیون DNA/DNA با غوطه‌ورسازی الکترود طلای اصلاح شده با ssDNA در غلظت 1 میکرومولار DNA هدف انجام شد.

یافته‌ها: نتایج نشان داد که الکترود اصلاح شده با نانوذرات طلا پس از تثبیت ssDNA، به­طور مؤثری ژن rfbE باکتری اشریشیا کولی O157:H7 را ازطریق هیبریداسیون DNA تشخیص می‌دهد. نانوبیوسنسور گزینش­پذیری بسیار خوبی در تشخیص توالی DNA هدف نسبت به توالی دارای باز ناجور و توالی غیر مکمل نشان داد.

نتیجه­گیری: با توجه به نتایج به­دست آمده و بررسی مطالعات مشابه، نانوبیوسنسور الکتروشیمیایی مبتنی بر هیبریداسیون DNA، دارای مزایایی ازجمله هزینه­ی کم، سادگی و کوچک سازی می‌باشد و می‌تواند زمینه‌ای برای توسعه­ی ابزار تشخیص ژنومی را فراهم آورد.

واژه­های کلیدی: باکتری اشریشیاکولی O157:H7، نانوبیوسنسور، هیبریداسیون DNA

 

 

مقدمه[F1] 

باکتری اشریشیاکولی سروتیپ O157 به­دنبال دو واقعه­ی اپیدمیولوژیکی شناسایی شد. اولین گزارش درسال 1983 توسط ری­لی و همکارانش براثر شیوع بیماری گوارشی همراه با دردهای شکمی، اسهال آبکی و به دنبال آن اسهال خونی شدید بود و آنها  این بیماری را که  انتقال آن از راه توزیع همبرگرهای نیم­پخته­ی آلوده در یک فست فود بود، به­عنوان کولیت هموراژیک درنظرگرفتند (1). دومین مطالعه توسط کارمالی و همکارانش انجام شد، در این تحقیق آن­ها ارتباط بین سندروم اورمی همولیتیک را با سیتوتوکسین مدفوعی گزارش کردند (2).

روش‌های شناسایی متعارف عوامل بیولوژیک شامل کشت و شمارش کلنی، سنجش تکنیک‌های ایمنی و سرولوژی (مبتنی بر فلورسانس با استفاده از مولکول‌های رنگی آلی) و واکنش زنجیره‌ای پلیمراز (PCR) می باشد. اما این روش‌ها دشوار، پیچیده و وقت­گیر هستند و برخی از آنها ویژگی­های لازم برای ردیابی هدف را ندارند (3).

بیوسنسور DNA در طول دهه­ی گذشته، در زمینه­ی تجزیه و تحلیل ژن، تشخیص اختلالات ژنتیکی، تشخیص عوامل بیولوژیک، تطبیق بافت، کاربردهای پزشکی و پزشکی قانونی توسعه­ی قابل توجهی داشته است(4). به­ویژه هیبریداسیون DNA برای تشخیص عوامل بیولوژیک با توجه به پتانسیل فوق العاده­ی شناسایی مولکولی آن، بسیار مناسب است. حسگرهای زیستی DNA، از اتصال ترجیحی مکمل تک رشته توالی اسید نوکلئیک، بهره می­برند. این سیستم معمولا به ثابت کردن پروب DNA تک رشته‌ای (ssDNA) روی یک سطح برای تشخیص توالی هدف DNA مکمل خود از طریق هیبریداسیون متکی است (4، 5).

در حال حاضر، مطالعات و تحقیقات زیادی به ارتقای حساسیّت تشخیص و انتخاب­گری بیوحسگرهای الکتروشیمیایی DNA معطوف شده است (6). ازآنجاکه بیوسنسور‌ها ابزاری توانمند جهت شناسایی مولکول‌های زیستی می‌باشند، امروزه از آنها در علوم مختلف پزشکی، صنایع شیمیایی، صنایع غذایی، مانیتورینگ محیط زیست، تولید محصولات دارویی، بهداشتی و غیره بهره می‌گیرند.

تحولات اخیر در نانومواد، فرصت‌های زیادی برای پیشبرد سنجش DNA و تشخیص ژن ایجاد می‌کند. از نانومواد، به­طورگسترده‌ای به­عنوان یک واسطه­ی تقویت سیگنال به­منظور افزایش حدّ تشخیص DNA استفاده شده است (7). اگرچه تحقیقات زیادی در مورد اصلاح الکترود توسط نانوموادهای مختلف برای بهبود عملکرد بیوحسگر DNA  گزارش شده، اما آماده سازی نانومواد و یا استراتژی اصلاح الکترود اغلب پیچیده است. علاوه بر این، برخی از حسگرهای زیستی DNA مبتنی بر نانومواد اصلاح شده هنوز هم برای بهبود عملکرد بیوحسگر DNA محدودیت‌هایی دارند(8).

در این کار تحقیقاتی، پس از اصلاح سطح الکترود با نانوذرات طلا به تشخیص اولیگونوکلئوتید ژن rfbE باکتری اشریشیا کولی O157:H7 با روش طیف بینی امپدانس الکتروشیمیایی مبتنی بر هیبرداسیون DNA پرداخته شد.

 

مواد و روش­ها

در این مطالعه­ی تجربی، توالی ژن rfbE از بانک ژن (با شماره­ی Accession No:CP008957.1)، استخراج شد و آغازگرها و اولیگونوکلئوتیدها توسط نرم­افزارOligo 7  و Primer 3، طراحی و از شرکت Bioneer Corporation کشور کره جنوبی خریداری شد. این اولیگونوکلئوتیدها شامل آغازگرهای پیشرو و پیرو، توالی 23 مری تیوله شده در انتهای ¢5 به همراه فضاساز C6، توالی 23 مری کاملا مکمل، توالی 23 مری دارای دو باز ناجور و توالی 23 مری غیر مکمل می‌باشند (جدول 1).

تشخیص ژن rfbE با روش PCR

در ابتدا یک کلنی تک از محیط کشت نوترینت آگار به محیط کشت LB براث، تلقیح و 24 ساعت در گرمخانه­ی 37 درجه سانتی­گراد قرارداده شد. سپس، 200 میکرولیتر از محیط فوق، برداشته و با دور 5000 به مدت 3 دقیقه، سانتریفی‍وژگردید. مایع رویی دور ریخته شد و به رسوب حاصل، مقدار 500 میکرولیتر آب مقطر اضافه گردید و سپس به­مدت 10 دقیقه در آب جوش جوشانده شد. مقدار 1 میکرولیتر از این محلول به­عنوان الگو در آزمایش PCR توسط آنزیم pfu DNA پلیمراز (تهیه­شده از شرکت تکاپوزیست) مورد استفاده قرارگرفت. آغازگرهای پیشرو و پیرو هر کدام به میزان 4 دهم پیکومول، نمک MgSO4 با غلظت 2 میلی­مولار،  dNTP با غلظت 2 دهم میلی­مولار و 5/2 میکرولیتر بافر آنزیم پلیمراز با غلظت 10X برای حجم نهایی واکنش 25 میکرولیتری مورد استفاده واقع شدند. فرآیند بهینه­سازی و اتصال آغازگرها در واکنش  PCR انجام شد (جدول 2).

تشخیص ژن rfbE با روش طیف بینی امپدانس الکتروشیمیایی

رسوب الکتروشیمیایی نانوذرات طلا روی الکترود

            محلول 5 میلی­مولار  HAuCl4 برای pH برابر 5 با محلول سود و هیدروکلراید تنظیم شد و برای حدود 12 ساعت در این شرایط باقی ماند. نانوساختارهای طلا روی الکترود مسطح طلا با قطر 2 میلیمتر در پتانسیل ثابت 5 دهم ولت در دمای اتاق به­مدت 300 ثانیه و در شرایط هم زن 500 دور در دقیقه، به روش رسوب الکتروشیمیایی ته نشین شدند. جهت بررسی سطح اصلاح شده با نانوساختارهای طلا توسط میکروسکوپ الکترونی نگاره (SEM) از سطح تصویر برداری شد. در بین انواع نانومواد، اغلب برای ساخت بیوحسگر الکتروشیمیایی با توجه به استراتژی‌های تابع سطح و سهولت کار و همچنین زیست سازگاری خوب، از نانوذرات طلا استفاده می‌شود (16). نانوذرات طلا به­راحتی بر روی سطح الکترود توسط برخی از استراتژی‌ها نظیر روش‌های تجمع الکترواستاتیک مستقیم (direct electrostatic assembly)، اتصال کووالانسی (covalent linking)، به دام افتادن پلیمر (polymer entrapment) و رسوب الکتروشیمیایی (گالوانوتکنیک، آبکاری یا electrodeposition) متصل می‌شود. روش رسوب الکتروشیمیایی به­طور گسترده برای اصلاح بستر استفاده می‌گردد. نانوساختارهای طلا با مورفولوژی‌های مختلف توسط روش آب­کاری به­دست آمده است. مورفولوژی نهایی نانوذرات طلا می‌تواند به­راحتی توسط تغییرات ساده­ی pH محلول پیش سازهای طلا کنترل شود. توسعه نانوساختارها ممکن است پلت فرم با ارزشی برای کاربردهای بیوحسگر DNA، حتی پروتئین و آنزیم بیوحسگر را فراهم نماید (9).

تثبیت ssDNA روی سطح الکترود اصلاح شده

برای تثبیت توالی DNA روی الکترود طلای اصلاح شده، اولیگومر ssDNA تیوله در موقعیت¢5 (1 میکرومولار) به همراه الکترود طلا درون بافر تثبیت، به­مدت دو ساعت غوطه‌ور شد. بافرِ تثبیت شامل Tris–HCl 10 میلی­مولار، EDTA 1 میلی­مولار و KH2PO4 1 مولار، pH برابر 7 می‌باشد (10). توالی ssDNA تیوله یک تک­لایه­ی خودتجمعی را به دلیل تمایل بالای گروه تیول نسبت به طلا، روی سطح الکترود تشکیل می‌دهد. پس از فرایند جذب شیمیایی، الکترود با آب دوبار تقطیر شستشو داده تا رشته‌هایی که به­صورت ضعیف متصل شده‌اند حذف شوند. پس ازآن، برای تشکیل تک­لایه‌های تیول مخلوط، الکترود اصلاح شده در محلول مرکاپتوهگزانول و مرکاپتوپروپیونیک اسید (2 میلی مولار) در بافرِ سیترات (100 میلی­مولار، pH برابر 4/2) به­مدت 1 ساعت غوطه‌ور شد.

هیبریداسیون DNA روی الکترود اصلاح شده

پس از تثبیت ssDNA روی سطح الکترود طلای اصلاح شده، برای هیبریداسیون با DNA مکمل، الکترود طلای آماده شده مرحله­ی قبل در بافر هیبریداسیون به­مدت 30 دقیقه غوطه­ور شد. پس ازآن، الکترود با بافر فسفات شستشو داده شد. بافر هیبریداسیون شامل Tris–HCl 10 میلی­مولار، EDTA 1 میلی­مولار و NaCl 1 مولار، pH برابر 7 به همراه 1 میکرومولار DNA مکمل می‌باشد. همین روش برای هیبریداسیون با توالی دارای باز ناجور و توالی غیر مکمل انجام شد (9، 21).

اندازه‌گیری الکتروشیمیایی

طیف امپدانس الکتروشیمیایی در حضور زوج ردوکسK3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6]  در غلظت‌های 2 میلی­مولار و با استفاده از سه الکترود متشکل از یک الکترود مرجع Ag/AgCl (در KCl 3 مولار)، یک الکترود کمکی سیم پلاتین و الکترود اصلاح شده طلا به­عنوان الکترود کار، ثبت شد. پتانسیل DC ثابت (220 میلی­ولت در مقابل Ag/AgCl) استفاده شده است. فرکانس مدولاسیون (تعدیل) AC از 1 کیلوهرتز تا 10 مگا هرتز با 60 نقطه اندازه‌گیری شده انتخاب شد. بررسی‌های الکتروشیمیایی با استفاده از دستگاه پتانسیواستا/گالوانواستا FAR 2 μAutolab III دارای آنالیزکننده­ی پاسخ فرکانسی ساخت شرکت Eco Chemie هلند انجام گرفت (شکل 1).

 

یافته‌ها

واکنش زنجیره‌ای پلیمراز ژن rfbE بوسیله آغازگرهای اختصاصی

پس از دریافت آغازگرها و آماده­سازی آن­ها، واکنش PCR برای تکثیر ژن rfbE در دماهای اتصال مختلف آغازگر به رشته الگو توسط آنزیم pfu DNA پلیمراز انجام شد (شکل 2).

بررسی الکترود اصلاح شده با نانوساختار طلا

الکترود اصلاح شده با نانوساختار طلا ابتدا توسط روش رسوب الکتروشیمیایی، تهیه و پس از آن به­عنوان بستر برای تثبیت و هیبریداسیون DNA استفاده شد. شکل 3 تصویر SEM  به­دست آمده از نانوساختارهای طلا را در pH  برابر 5 بر روی بستر طلا  نشان می‌دهد. با تنظیم pH به 5، ذرات شبیه شکوفه در بستر الکترود مشاهده می‌شود. با استفاده از نرم­افزار Measurement ابعاد نانوساختار طلا به­صورت میانگین حدود 30 ±100 نانومتر تعیین شد. الکترود اصلاح شده با نانوساختارهای طلای به­دست آمده در pH برابر 5 به مدت 300 ثانیه برای ساخت نانوبیوحسگر DNA مورد استفاده قرارگرفت.

بررسی تثبیت ssDNA روی سطح الکترود

پس از اصلاح الکترود توسط نانوذرات طلا، تثبیت ssDNA روی سطح الکترود اصلاح شده با روش طیف بینی امپدانس الکتروشیمیایی مطالعه شد. طیف بینی امپدانس الکتروشیمیایی، روشی مناسب برای تثبیت و هیبریداسیون DNA/DNA روی سطح الکترود می‌باشد. طیف امپدانس شامل یک بخش نیم­دایره در فرکانس‌های بالا (نمودار نایکوئیست) مربوط به فرایند کنترل شده با فرآیند انتقال الکترون و یک بخش خطی در فرکانس‌های پایین‌تر مربوط به مرحله­ی کنترل­شده با انتشار در فرایند الکتروشیمیایی است. قطر نیم­دایره برابر با مقاومت انتقال بار است که رفتار سطح الکترود برای زوج رودکس را نشان می‌دهد و بنابراین می‌تواند به­عنوان علامتی برای مشخص­کردن تغییر در مراحل تثبیت و هیبریداسیون مورد استفاده قرارگیرد. اندازه‌گیری‌های امپدانس الکتروشیمیایی یک الکترود طلای اصلاح شده با نانوذرات طلا و تثبیت شده با ssDNA درشکل 4 نشان داده شده است. همانگونه که در شکل 4 الف مشاهده می‌شود، نمودار نایکوئیست الکترود طلای اصلاح شده با نانوذرات طلا تقریباً به­صورت یک خط مستقیم است که نشان­دهنده­ی کنترل فرآیند با انتشار است. لایه­ی خودتجمعی ssDNA و MCH/MPA بر روی الکترود به­عنوان یک لایه­ی عایق عمل کرده و مانع انتقال الکترون در سطح الکترود می­شود که نتیجه­ی آن مشاهده­ی یک نیم­دایره در فرکانس‌های بالاتر می‌باشد (شکل 4 ب). نتایج به­دست آمده از روش طیف بینی امپدانس الکتروشیمیایی تایید می‌کند که تثبیت ssDNA و MCH/MPA روی سطح الکترود طلا به­خوبی انجام شده است.

بررسی هیبریداسیون DNA/DNA روی الکترود اصلاح شده

روی الکترود اصلاح شده با نانوذرات طلا، رشته‌های ssDNA ، تثبیت و پس از هیبریداسیون با اولیگونوکلئوتید مکمل، طیف امپدانس الکتروشیمیایی بررسی شد. مقاومت انتقال بار در نمودار نایکوئیست در الکترود اصلاح شده با نانوذرات بعد از هیبریداسیون DNA مکمل، افزایش یافته است. نتایج به­دست آمده نشان می‌دهد که بر هم کنش بین ssDNA تثبیت شده روی سطح الکترود اصلاح شده با نانوذرات طلا و DNA مکمل آن مناسب بوده و بیانگر تشخیص موفقیت آمیز قطعه‌ای از ژن rfbE باکتری اشریشیا کولی O157:H7 می‌باشد (شکل 5).

کارآیی و انتخاب­گری نانوبیوسنسور با استفاده از هیبریداسیون ssDNA تثبیت شده روی سطح الکترود اصلاح شده با سایر اولیگونوکلئوتیدها نظیر اولیگونوکلئوتید غیر مکمل و اولیگونوکلئوتید دارای ناجوری بررسی شد. نتایج نشان داد که نانوبیوسنسور در هیبریداسیون ssDNA با اولیگونوکلئوتید مکمل، باعث افزایش مقاومت انتقال بار می‌شود و اولیگونوکلئوتید هدف را شناسایی می‌کند. از طرفی دیگر، نانوبیوسنسور در هیبریداسیون ssDNA با اولیگونوکلئوتید غیر مکمل و اولیگونوکلئوتید دارای ناجوری، تغییر قابل ملاحظه‌ای را در طیف امپدانس الکتروشیمیایی نشان نمی‌دهد (شکل6).

بحث

نتایج به­دست آمده از آزمایش­های این تحقیق نشان داد که الکترود اصلاح شده با نانوذرات طلا که روی سطح آن ssDNA تثبیت شده است می‌تواند براساس روش طیف بینی امپدانس الکتروشیمیایی مبتنی بر هیبریداسیون dsDNA، بخشی از ژن rfbE باکتری E. coli O157:H7 را شناسایی کند. برای شناسایی باکتری اشریشیاکولی سویه O157 آزمایشهایی نظیر مشاهده­ی مستقیم و بررسی میکروسکوپی نمونه، رنگ آمیزی، کشت و بررسی کلنی‌ها، کشت در محیط‌های اختصاصی و افتراقی و غیره، نیازمندی­های تغذیه‌ای و رشد، منبع کربن مورد استفاده، تلقیح در محیط کشت سوربیتول- مک کانگی آگار، انجام آزمایش­های سرولوژیک و روش­های ژنتیکی وجود دارد (11). روش­های متداول قدیمی دقت و سرعت شناسایی مطلوبی ندارند. روش­های ژنتیکی مانند PCR، دارای حساسیّت و ویژگی مطلوبی هستند، اما دارای پیچیدگی و دشواری در انجام آزمایش­ها می‌باشند(12). لذا تشخیص ژن rfbE باکتری اشریشیا کولی O157:H7 با روش­های آسان، سریع و دقیق ضرورت دارد و ابزاری نظیر نانوبیوسنسور می­تواند این چالش را مرتفع نماید.

حسگر بیولوژیک، تلفیقی از زیست شناسی و الکترونیک است.  با به­کارگیری گیرنده‌های اختصاصی که می‌تواند مبتنی بر سیستم‌های آنزیمی، واکنش‌های آنتی‌ژن- آنتی‌بادی و یا هیبریداسیون DNA باشد، استفاده از گیرنده­ی بسیار اختصاصی عوامل بیولوژیک و پیوند آن با نشانگرهای الکترونیک می‌تواند به­عنوان یک شناساگر فوق حساس و اختصاصی عمل کند. به­نحوی که باحضور غلظت بسیار کمی ‌از عامل و پیوند آن با گیرنده­ی اختصاصی، با ارسال امواجی موجب فعال شدن بخش الکترونیک حسگر شده و درنتیجه هشدار حضور عامل به دستگاه­ها و مراکز کنترل صادر می‌گردد (13).

حسگرهای زیستی معمولاً قابلیت­هایی دارند که با بهره‌گیری از ویژگی عمل و خصوصیات ماده­ی بیولوژیک خود یک ترکیب یا گروهی از ترکیبات مشابه را شناسایی و با آنها برهم کنش نمایند و نتیجه را به­صورت یک پیام الکتریکی گزارش کنند. این پیام همواره با غلظت ترکیب مورد سنجش دارای تناسب کمی است. این ابزارها در گستره­ی وسیعی از کاربردهای آنالیتیکی نظیر تشخیص‌های پزشکی و علوم آزمایشگاهی، کنترل‌های زیست محیطی، کنترل فرآیندهای صنعتی و سرانجام هشداردهنده‌های ایمنی کارآیی دارند (4).

با توجه به نتایج به­دست آمده در این مطالعه مشخص­می‌شود که برای مطالعه­ی فرآیند هیبریداسیون DNA/DNA روش طیف بینی امپدانس الکتروشیمیایی، یک تکنیک مناسب با حساسیت و کارآیی بالا می‌باشد. حسگرهای DNA براساس تشخیص EIS، بدون برچسب هستند و بنابراین، دارای مزایای استفاده ازجمله هزینه­ی کم، سادگی، سهولت و کوچک‌سازی می‌باشند. با این­حال، حسگرهای زیستیDNA  برای تشخیص عوامل بیولوژیک دارای محدودیت‌هایی هستند (14، 15). استفاده از نانوذرات برای ساخت الکترود اصلاح شده با نانوساختار طلا، یک استراتژی ساده برای بهبود حساسیت تشخیصDNA  می‌باشد (16). در این مطالعه، توالی تثبیت شده ssDNA روی سطح الکترود اصلاح شده با نانوذرات طلا، اولیگونوکلئوتید خاصی از باکتری را تشخیص می‌دهد و این موضوع می‌تواند برای توسعه­ی حسگرهای بیولوژیک جهت آشکارسازی عوامل بیولوژیک مورد استفاده قرارگیرد.

 

تشکر و قدردانی

از تمامی استادان، پژوهشگران و همکاران محترم در دانشگاه جامع امام حسین(ع)، که در به نتیجه رسیدن این تحقیق تلاش فراوان کردند، تشکر و سپاسگزاری می­شود.

 

References

  1. Riley LW, Remis RS, Helgerson SD, McGee HB, Wells JG, Davis BR, et al. Hemorrhagic colitis associated with a rare Escherichia coli serotype. N Engl J Med. 1983;308(12):681-5.
  2. Karmali MA, Petric M, Bielaszewska M. Evaluation of a microplate latex agglutination method (Verotox-F) for detecting and characterizing verotoxins (Shiga toxins) in Escherichia Coli. J Clin Microbiol. 1999 Feb; 37(2): 396–9.
  3. Sanvicens N, Pastells C, Pascual N, Marco MP. Nanoparticle-based biosensors for detection of pathogenic bacteria. Anal Chem. 2009;28(11) 1243-52.
  4. Gunnarsson A, Jonsson P, Marie R, Tegenfeldt JO, Hook F. Single-molecule Detection and Mismatch Discrimination of Unlabeled DNA Targets. Nano Lett. 2008;8 (1): 183–8.
  5. Minaei ME, Saadati M, Najafi M, Honari H. Immobilization and Hybridization of DNA/DNA of the rfbE Gene Escherichia Coli O157:H7 on Gold Electrode Surface for the Detection of Specific Sequences by Electrochemical Impedance Spectroscopy Method. Passive Defence Sci & Tech. 2014; 4: 279-83. [Persian]
  6. Kannan B, Williams DE, Booth MA, Travas-Sejdic J. High-sensitivity, label-free DNA sensors using electrochemically active conducting polymers. Anal Chem. 2011;83(9),3415-21.
  7. Katz E, Willner I, Wang J, Electroanalytical and bioelectroanalytical systems based on metal and semiconductive nanoparticles. Electroanalysis. 2004;16(1-2), 19–44.
  8. Liu S, Liu J, Han X, Cui Y, Wang W. Electrochemical DNA biosensor fabrication with hollow gold nanospheres modified electrode and its enhancement in DNA immobilization and hybridization. Biosen. Bioelectron. 2010;25(7): 1640–5.
  9.  Seo B, Choi S, Kim J. Simple electrochemical deposition of au nanoplates from au(I) cyanide complexes and their electrocatalytic activities. ACS Appl Mater Interfaces. 2011;3(2): 441–6.
  10. Steel AB, Herne TM, Tarlov MJ. Electrochemical Quantitation of DNA Immobilized on Gold. Anal Chem. 1998; 70(2): 4670 -7.
  11. Deisingh AK, Thompson M. Strategies for the detection of Escherichia coli O157:H7 in foods. J Appl Microbiol. 2004;96(3):419–29.
  12. Oda M, Morita M, H U, Tanji Y. Rapid Detection of Escherichia coli O157:H7 by Using Green Fluorescent Protein-Labeled PP01 Bacteriophag. Appl Environ Microbiol. 2004; 70(1): 527–34.
  13. Pohanka M, Skladai P. Electrochemical biosensors—principles and applications. J Appl Biomed. 2008;6:57–64.
  14. Daniels JS, Pourmand N. Label-free impedance biosensors: opportunities and challenges. Electroanalysis. 2007;19(12):1239–57.
  15.  Zhou N, Yang T, Jiang C, Du M, Jiao K. Highly sensitive electrochemical impedance spectroscopic detection of DNA hybridization based on Au-nano-CNT/PAN(nano) films. Talanta. 2009;77(3):1021–6.
  16. Li G, Li X, Wan J, Zhang S. Dendrimers-based DNA biosensors for highly sensitive electrochemical detection of DNA hybridization using reporter probe DNA modified with Au nanoparticles. Biosens Bioelectron. 2009;24:3281–7.


A Modified Electrochemical Electrode for Development of Nanobiosensor for the Detection of rfbE Gene of Escherichia Coli O157:H7

 

* Mohammad Ebrahim Minaei

Ph.D Student of Nanobiotechnology, Department of Biology, Faculty of Basic Science, Imam Hosein University, Tehran, Iran

 

Mojtaba Saadati

Professor, Department of Biology, Faculty of Basic Science, Imam Hosein University, Tehran, Iran

 

Mostafa Najafi

Associate Professor, Department of Chemistry, Faculty of Basic Science, Imam Hosein University, Tehran, Iran

 

Hossein Honari

Associate Professor, Department of Biology, Faculty of Basic Science, Imam Hosein University, Tehran, Iran

 

Received:11/03/2015, Revised:27/04/2015, Accepted:09/07/2015


Abstract
Background & Objectives: Nanobiosensors could be used instead of traditional detection methods of Escherichia coli O157:H7. In this paper, a nanobiosensor for detection of rfbE gene of the Escherichia coli O157:H7 has been studied by immobilization and hybridization single strand DNA (ssDNA) sequences on the electrode surface modified with gold nanoparticles.

Materials & Methods: Electrochemical impedance spectroscopy technique was used to study the properties of the sensing modified electrode. The working electrode surface was modified by electrochemical method with gold nanoparticles. The single-stranded DNA sequence using self-assembled monolayer was immobilized on the gold electrode for two hours. A mixed monolayer comprising both mercaptohexanol (MCH) and mercaptopropionic acid (MPA) were used as blocking layer. The hybridization DNA/DNA was performed by immersion of the modified gold electrode into ssDNA at a concentration of 1 μM  target DNA.

Results: The results showed that the electrode modified with gold nanoparticles after immobilizing ssDNA effectively detected rfbE gene of Escherichia coli O157:H7 by DNA hybridization . The nanobiosiosensor showed suitable selectivity for the detection of target DNA complementary sequence compared with the mismatched oligonucleotides sequence and the noncomplementary oligonucleotides sequence.
Conclusion: According to the results obtained and similar studies, the electrochemical nanobiosensor based on DNA hybridization has advantages such as low cost, simplicity, and miniaturization and can provide a basis for the development of genomic detection tools.
Keywords: DNA hybridization, Escherichia coli O157:H7, Nanobiosensor. 
 
 
 
 
 
Corresponding author: 

Mohammad Ebrahim Minaei,

Department of Biology, Faculty of Basic Science, Imam Hossein University, Tehran, Iran

E-mail: mminaii@ihu.ac.ir


  1. Riley LW, Remis RS, Helgerson SD, McGee HB, Wells JG, Davis BR, et al. Hemorrhagic colitis associated with a rare Escherichia coli serotype. N Engl J Med. 1983;308(12):681-5.
  2. Karmali MA, Petric M, Bielaszewska M. Evaluation of a microplate latex agglutination method (Verotox-F) for detecting and characterizing verotoxins (Shiga toxins) in Escherichia Coli. J Clin Microbiol. 1999 Feb; 37(2): 396–9.
  3. Sanvicens N, Pastells C, Pascual N, Marco MP. Nanoparticle-based biosensors for detection of pathogenic bacteria. Anal Chem. 2009;28(11) 1243-52.
  4. Gunnarsson A, Jonsson P, Marie R, Tegenfeldt JO, Hook F. Single-molecule Detection and Mismatch Discrimination of Unlabeled DNA Targets. Nano Lett. 2008;8 (1): 183–8.
  5. Minaei ME, Saadati M, Najafi M, Honari H. Immobilization and Hybridization of DNA/DNA of the rfbE Gene Escherichia Coli O157:H7 on Gold Electrode Surface for the Detection of Specific Sequences by Electrochemical Impedance Spectroscopy Method. Passive Defence Sci & Tech. 2014; 4: 279-83. [Persian]
  6. Kannan B, Williams DE, Booth MA, Travas-Sejdic J. High-sensitivity, label-free DNA sensors using electrochemically active conducting polymers. Anal Chem. 2011;83(9),3415-21.
  7. Katz E, Willner I, Wang J, Electroanalytical and bioelectroanalytical systems based on metal and semiconductive nanoparticles. Electroanalysis. 2004;16(1-2), 19–44.
  8. Liu S, Liu J, Han X, Cui Y, Wang W. Electrochemical DNA biosensor fabrication with hollow gold nanospheres modified electrode and its enhancement in DNA immobilization and hybridization. Biosen. Bioelectron. 2010;25(7): 1640–5.
  9.  Seo B, Choi S, Kim J. Simple electrochemical deposition of au nanoplates from au(I) cyanide complexes and their electrocatalytic activities. ACS Appl Mater Interfaces. 2011;3(2): 441–6.
  10. Steel AB, Herne TM, Tarlov MJ. Electrochemical Quantitation of DNA Immobilized on Gold. Anal Chem. 1998; 70(2): 4670 -7.
  11. Deisingh AK, Thompson M. Strategies for the detection of Escherichia coli O157:H7 in foods. J Appl Microbiol. 2004;96(3):419–29.
  12. Oda M, Morita M, H U, Tanji Y. Rapid Detection of Escherichia coli O157:H7 by Using Green Fluorescent Protein-Labeled PP01 Bacteriophag. Appl Environ Microbiol. 2004; 70(1): 527–34.
  13. Pohanka M, Skladai P. Electrochemical biosensors—principles and applications. J Appl Biomed. 2008;6:57–64.
  14. Daniels JS, Pourmand N. Label-free impedance biosensors: opportunities and challenges. Electroanalysis. 2007;19(12):1239–57.
  15.  Zhou N, Yang T, Jiang C, Du M, Jiao K. Highly sensitive electrochemical impedance spectroscopic detection of DNA hybridization based on Au-nano-CNT/PAN(nano) films. Talanta. 2009;77(3):1021–6.
  16. Li G, Li X, Wan J, Zhang S. Dendrimers-based DNA biosensors for highly sensitive electrochemical detection of DNA hybridization using reporter probe DNA modified with Au nanoparticles. Biosens Bioelectron. 2009;24:3281–7.